DMF aumenta la expresión de FXN in vitro e in vivo en modelos de células y ratones FA

Para estudiar el efecto de DMF en FXN expresión nos tratados derivados del paciente FA de células de linfoblastos GM14518, GM15850, GM16214, GM16216 y GM16220 que tiene un número diferente de repeticiones GAA ( S1 Tabla) con 1, 3, 10, 30 y 100? M DMF para 24 h. La expresión del ARNm de FXN se midió mediante qRT-PCR. Observamos un aumento dependiente de la dosis en la expresión del ARNm de FXN con un aumento significativo a 10 μM y 30 μM de concentración de DMF en un 25% y 93% respectivamente, en comparación con su respectivo control tratado con vehículo ( Fig. 1A ). La dosis de 100 µM fue tóxica y provocó una muerte celular significativa y rendimientos de ARN muy bajos. También confirmamos un aumento en la expresión de FXN a nivel de proteína con el tratamiento con DMF en células de linfoblastos (S1 Fig ). En general, DMF aumentó significativamente la expresión de FXN en varios modelos de células de linfoblastos derivados de pacientes.

Efecto de los bucles R en la expresión del gen FXN

Las expansiones repetidas de GAA en el primer intrón del gen FXN dan como resultado una disminución de la expresión de la proteína FXN. Comprender la relación mecánica entre el aumento de las repeticiones de GAA y la reducción de la expresión de FXN es importante para los enfoques terapéuticos para FA. La repetición de GAA expandida genera una región con alta asimetría de cadena G versus C o sesgo de GC, que favorece termodinámicamente la re-invasión del transcrito rico en GA en la cadena de ADN de la plantilla detrás de la ARN polimerasa que avanza, formando así bucles-R Se ha demostrado que la formación del bucle R juega un papel vital en la terminación de la transcripción en humanos y, por lo tanto, podría llevar a una pausa y / o terminación en el intrón 1 de FXN como se observa aquí ( Fig. 3 ).

Un modelo alternativo para el efecto del bucle R es el reclutamiento de marcas de histonas represivas, lo que lleva a la compactación de la cromatina [ 21 – 23 ]. La propagación de tales modificaciones represivas a la región promotora podría conducir al silenciamiento epigenético. Como alternativa, la compactación de la cromatina podría llevar a una reducción del alargamiento a través de las repeticiones de GAA, como se ha observado [ 24 ]. Por lo tanto, los R-loops podrían disminuir la expresión de FXN al causar la terminación prematura de la transcripción y / o disminuir el inicio o el alargamiento de la transcripción debido a la compactación de la cromatina.

La evidencia reciente también sugiere un posible mecanismo mediante el cual R-loop puede reclutar marcas represivas de histonas. La formación de R-loops en las repeticiones GAA expandidas deja a la cadena de ADN no plantilla rica en GA en un estado de cadena única que es accesible a la maquinaria de transcripción. Se ha demostrado que esto desencadena la transcripción de ARN antisentido [ 25 ]. Los transcritos de FXN sentido y antisentido pueden conducir a la formación de dsRNA reclutando así la maquinaria de interferencia de ARN y disminuyendo aún más la formación del transcrito de FXN maduro al cortar el ARNm existente utilizando el complejo RISC y / o la formación de marcas de histonas represivas [ 23 ].

DMF induce la expresión de FXN mediante un aumento de la iniciación de la transcripción

Mostramos que DMF induce la expresión FXN a través de un aumento de la iniciación transcripcional. Esto potencialmente reduce la pausa de la transcripción ( Fig. 3 ) y reduce la frecuencia de la formación del bucle R en los genes FXN mutantes. Una posible causa del aumento de los eventos de iniciación de FXN es el aumento de la activación a través del mecanismo mediado por Nrf2, como se describió anteriormente para la Dyclonine. En este punto de vista, el DMF, que es un conocido inductor de Keap1 / Nrf2, desencadena la unión de Nrf2 a 3 elementos de respuesta antioxidante (ARE) aguas arriba del gen FXN, lo que desencadena un mayor inicio de la transcripción [ 11 ]. Otra posibilidad es que la DMF, que impulsa la expresión de los factores de biogénesis mitocondrial NRF1 y TFAM [ 26].] dirige la expresión de todas las proteínas mitocondriales, incluido el FXN, como consecuencia del aumento de la biogénesis mitocondrial en general ( Fig. 5 ).

DMF induce la biogénesis mitocondrial y FXN a las concentraciones que alcanza en la dosificación humana

La ataxia de Friedreich es una enfermedad rara, autosómica recesiva causada por el agotamiento de la proteína mitocondrial FXN, cuyo papel probable es en la biogénesis de los grupos Fe-S. La pérdida de FXN da como resultado una disminución en el número de copias mitocondriales [ 10 ], que afecta principalmente a los tejidos que requieren mucha energía, incluidos los ganglios de la raíz dorsal, los núcleos del cerebelo dentado, el músculo esquelético y el corazón. Las características clínicas primarias implican una pérdida progresiva de la coordinación y el equilibrio musculares, lo que conduce a la marcha y la ataxia de las extremidades, lo que resulta en una silla de ruedas sujeta a medida que avanza la enfermedad. La cardiomiopatía es la principal causa de muerte en la FA [ 27 , 28 ]. Actualmente no hay terapia aprobada para FA [ 29]. Aquí mostramos que la DMF, aprobada para uso en humanos para la esclerosis múltiple y la psoriasis, induce de manera dependiente de la dosis la expresión de FXN cuya deficiencia es la única causa de la FA, y también induce la biogénesis mitocondrial. Tanto la inducción de FXN como la inducción de biogénesis mitocondrial se producen a ~ 10 μM, que está cerca de la concentración de ~ 7 μM alcanzada por el metabolito bioactivo principal de DMF, MMF, en dosis de 480 mg en humanos.

DMF como terapia potencial para FA

Mostramos que el DMF aumenta la expresión de FXN en un 93% en el modelo de células de linfoblastos derivados de FA a una dosis de 30 μM, en un 52% en ratones con FA Yg8 a una dosis de 10 mg / kg y en un 85% en pacientes con EM tratados durante 3 meses. Existe una co-relación positiva entre el nivel de FXN del paciente con FA en la sangre hasta la edad de inicio de la enfermedad [ 30 ]. Este modesto aumento en FXN es altamente relevante desde el punto de vista clínico ya que el aumento en FXN en ~ 80% ( Fig. 2 ) tiene el potencial de retrasar la edad de inicio de FA en muchos años.

También es importante subrayar que la expresión del ARNm de FXN se reduce al 19,4% en pacientes con AF y al 53% en portadores, en comparación con los controles sanos [ 31 ]. Los portadores son individuos sanos que descubren su estado solo durante el asesoramiento genético, y su condición nunca se ha relacionado con ninguna anomalía neurológica o cardiológica. Por lo tanto, el aumento en el ARNm de FXN después del tratamiento con DMF puede ser efectivo para contrarrestar el proceso patológico de reducción de FXN en el aumento encontrado después de la administración in vivo. Por lo tanto, la DMF es única, es segura y bien tolerada, tiene más de 200,000 pacientes tratados en todo el mundo por esclerosis múltiple y psoriasis. Esto sugiere que debe considerarse como una terapia para la ataxia de Friedreich.