Fuente, 4 de junio de 2019

La ataxia de Friedreich (FA) es un trastorno neurodegenerativo hereditario que resulta de la disminución de la expresión de la proteína mitocondrial frataxina, para la cual no existe una terapia aprobada.

El análisis de alto rendimiento de los fármacos utilizados clínicamente identificó dimetil fumarato (DMF) como protector en las células de pacientes con AF. Aquí demostramos que DMF aumenta significativamente la expresión del gen de la frataxina (FXN) en el modelo de células FA, el modelo de ratón FA y en humanos tratados con DMF. DMF también rescata la deficiencia de la biogénesis mitocondrial en el modelo de células derivadas de pacientes con FA.

Además, examinamos el mecanismo de la inducción de frataxina por DMF en células de pacientes con FA. Se ha demostrado que los bucles R inhibidores de la transcripción se forman en las mutaciones de expansión GAA, disminuyendo así la expresión de FXN. En las células de pacientes con FA, demostramos que la DMF aumenta significativamente el inicio de la transcripción.

Como consecuencia potencial, observamos una reducción significativa tanto en la formación del bucle R como en la pausa transcripcional, lo que aumenta significativamente la expresión de FXN.

Por último, los pacientes con esclerosis múltiple (EM) con dosificación de DMF mostraron un aumento significativo en la expresión de FXN en aproximadamente un 85%. Dado que la deficiencia hereditaria en FXN es la causa principal de FA, y se ha demostrado que DMF aumenta la expresión de FXN en humanos, DMF podría considerarse para la terapia de Friedreich.

 

Fuente

Resumen

La ataxia de Friedreich (FA) es un trastorno neurodegenerativo hereditario que resulta de la disminución de la expresión de la proteína mitocondrial frataxina, para la cual no existe una terapia aprobada. El análisis de alto rendimiento de los fármacos utilizados clínicamente identificó dimetil fumarato (DMF) como protector en las células de pacientes con AF. Aquí demostramos que DMF aumenta significativamente la expresión del gen de la frataxina ( FXN ) en el modelo de células FA, el modelo de ratón FA y en humanos tratados con DMF. DMF también rescata la deficiencia de la biogénesis mitocondrial en el modelo de células derivadas de pacientes con FA. Además, examinamos el mecanismo de la inducción de frataxina por DMF en células de pacientes con FA. Se ha demostrado que los bucles R inhibidores de la transcripción se forman en las mutaciones de expansión GAA, disminuyendo así la FXNexpresión. En las células de pacientes con FA, demostramos que la DMF aumenta significativamente el inicio de la transcripción. Como consecuencia potencial, observamos una reducción significativa tanto en la formación del bucle R como en la pausa transcripcional, lo que aumenta significativamente la expresión de FXN . Por último, los pacientes con esclerosis múltiple (EM) con dosificación de DMF mostraron un aumento significativo en la expresión de FXN en aproximadamente un 85%. Dado que la deficiencia hereditaria en FXN es la causa principal de FA, y se ha demostrado que DMF aumenta la expresión de FXN en humanos, DMF podría considerarse para la terapia de Friedreich.

 

 

Introducción

La ataxia de Friedreich (FA) es causada por la herencia de las expansiones de nucleótidos GAA y la expresión reducida de la proteína mitocondrial frataxina. FA es una enfermedad neurodegenerativa letal en última instancia para la cual actualmente no existe una terapia aprobada [ 1 ]. Todas las consecuencias fisiopatológicas, la gravedad y la edad de inicio de la FA están directamente relacionadas con el grado de deficiencia de frataxina, mayor es la deficiencia de frataxina, peor es el resultado [ 2 – 5 ]. Los síntomas comunes asociados con esta enfermedad incluyen pérdida de la coordinación muscular, cardiomiopatía, defecto auditivo y diabetes [ 6 , 7 ].

Aún no está claro cómo la deficiencia de la proteína mitocondrial frataxina desencadena el mecanismo patogénico de la FA, sin embargo, la mejor evidencia del papel fisiológico de la frataxina es que apoya la síntesis de grupos mitocondriales de hierro-azufre [ 8 , 9 ]. Recientemente, demostramos que la deficiencia de frataxina en células de pacientes con FA, ratones con FA y pacientes humanos con FA causa un defecto en la biogénesis mitocondrial [ 10 ], por lo que es posible que un defecto primario en los grupos de hierro-azufre (que es esencial para varios complejos de enzimas mitocondriales) causa el defecto de la biogénesis mitocondrial que finalmente desencadena la enfermedad.

Para identificar estrategias terapéuticas, seleccionamos 1.600 medicamentos de perfiles de seguridad conocidos que actualmente se utilizan para otras indicaciones en seres humanos [ 11 ]. El dimetil fumarato (DMF) proporcionó protección dependiente de la dosis en el cribado basado en células. Químicamente, la DMF es un éster metílico del ácido fumárico y actualmente se usa para tratar la esclerosis múltiple (EM) y la psoriasis [ 12 ]. Aquí, nuestro objetivo es analizar el efecto de la DMF sobre la expresión del gen de frataxina ( FXN ) en el modelo de células linfoblastas derivadas del paciente, los ratones modelo YG8 y en los linfocitos de la sangre de humanos a los que se les administró DMF.

Demostramos que DMF depende de la dosis y aumenta la expresión de FXN tanto en células de linfoblastos derivadas de pacientes con FA como en ratones in vivo . A nivel molecular, se cree que las repeticiones GAA heredadas reprimen la expresión de FXN a través de la formación de una estructura de bucle R termodinámicamente compuesta por un híbrido de ARN-ADN y una cadena única de ADN desplazada [ 13 , 14 ]. La presencia de R-loop en el sitio GAA expandido puede resultar en el estancamiento de la ARN polimerasa y la terminación prematura de la transcripción [ 15 – 17 ]. De manera mecánica, confirmamos que hay un aumento de R-loops en las regiones de repetición GAA en la FXNGen de la línea de células linfoblastoides derivadas del paciente. Además, demostramos que DMF aumenta significativamente la expresión de FXN en células FA al aumentar el inicio de la transcripción, lo que potencialmente reduce el enriquecimiento del bucle R y reduce aún más el bloqueo transcripcional en los sitios de pausa GAA como se demuestra aquí. Debido a que la deficiencia de frataxina mitocondrial es la causa principal de la FA, y la DMF aumenta significativamente la expresión de la FXN en varios modelos, sugerimos que la DMF podría considerarse como una posible terapia para la FA.

 

Resultados

DMF aumenta la expresión de FXN in vitro e in vivo en modelos de células y ratones FA

Para estudiar el efecto de DMF en FXN expresión nos tratados derivados del paciente FA de células de linfoblastos GM14518, GM15850, GM16214, GM16216 y GM16220 que tiene un número diferente de repeticiones GAA ( S1 Tabla) con 1, 3, 10, 30 y 100? M DMF para 24 h. La expresión del ARNm de FXN se midió mediante qRT-PCR. Observamos un aumento dependiente de la dosis en la expresión del ARNm de FXN con un aumento significativo a 10 μM y 30 μM de concentración de DMF en un 25% y 93% respectivamente, en comparación con su respectivo control tratado con vehículo ( Fig. 1A ). La dosis de 100 µM fue tóxica y provocó una muerte celular significativa y rendimientos de ARN muy bajos. También confirmamos un aumento en la expresión de FXN a nivel de proteína con el tratamiento con DMF en células de linfoblastos (S1 Fig ). En general, DMF aumentó significativamente la expresión de FXN en varios modelos de células de linfoblastos derivados de pacientes.

 

 

Discusión

Efecto de los bucles R en la expresión del gen FXN

Las expansiones repetidas de GAA en el primer intrón del gen FXN dan como resultado una disminución de la expresión de la proteína FXN. Comprender la relación mecánica entre el aumento de las repeticiones de GAA y la reducción de la expresión de FXN es importante para los enfoques terapéuticos para FA. La repetición de GAA expandida genera una región con alta asimetría de cadena G versus C o sesgo de GC, que favorece termodinámicamente la re-invasión del transcrito rico en GA en la cadena de ADN de la plantilla detrás de la ARN polimerasa que avanza, formando así bucles-R Se ha demostrado que la formación del bucle R juega un papel vital en la terminación de la transcripción en humanos y, por lo tanto, podría llevar a una pausa y / o terminación en el intrón 1 de FXN como se observa aquí ( Fig. 3 ).

Un modelo alternativo para el efecto del bucle R es el reclutamiento de marcas de histonas represivas, lo que lleva a la compactación de la cromatina [ 21 – 23 ]. La propagación de tales modificaciones represivas a la región promotora podría conducir al silenciamiento epigenético. Como alternativa, la compactación de la cromatina podría llevar a una reducción del alargamiento a través de las repeticiones de GAA, como se ha observado [ 24 ]. Por lo tanto, los R-loops podrían disminuir la expresión de FXN al causar la terminación prematura de la transcripción y / o disminuir el inicio o el alargamiento de la transcripción debido a la compactación de la cromatina.

La evidencia reciente también sugiere un posible mecanismo mediante el cual R-loop puede reclutar marcas represivas de histonas. La formación de R-loops en las repeticiones GAA expandidas deja a la cadena de ADN no plantilla rica en GA en un estado de cadena única que es accesible a la maquinaria de transcripción. Se ha demostrado que esto desencadena la transcripción de ARN antisentido [ 25 ]. Los transcritos de FXN sentido y antisentido pueden conducir a la formación de dsRNA reclutando así la maquinaria de interferencia de ARN y disminuyendo aún más la formación del transcrito de FXN maduro al cortar el ARNm existente utilizando el complejo RISC y / o la formación de marcas de histonas represivas [ 23 ].

 

DMF induce la expresión de FXN mediante un aumento de la iniciación de la transcripción

Mostramos que DMF induce la expresión FXN a través de un aumento de la iniciación transcripcional. Esto potencialmente reduce la pausa de la transcripción ( Fig. 3 ) y reduce la frecuencia de la formación del bucle R en los genes FXN mutantes. Una posible causa del aumento de los eventos de iniciación de FXN es el aumento de la activación a través del mecanismo mediado por Nrf2, como se describió anteriormente para la Dyclonine. En este punto de vista, el DMF, que es un conocido inductor de Keap1 / Nrf2, desencadena la unión de Nrf2 a 3 elementos de respuesta antioxidante (ARE) aguas arriba del gen FXN, lo que desencadena un mayor inicio de la transcripción [ 11 ]. Otra posibilidad es que la DMF, que impulsa la expresión de los factores de biogénesis mitocondrial NRF1 y TFAM [ 26].] dirige la expresión de todas las proteínas mitocondriales, incluido el FXN, como consecuencia del aumento de la biogénesis mitocondrial en general ( Fig. 5 ).

 

DMF induce la biogénesis mitocondrial y FXN a las concentraciones que alcanza en la dosificación humana

La ataxia de Friedreich es una enfermedad rara, autosómica recesiva causada por el agotamiento de la proteína mitocondrial FXN, cuyo papel probable es en la biogénesis de los grupos Fe-S. La pérdida de FXN da como resultado una disminución en el número de copias mitocondriales [ 10 ], que afecta principalmente a los tejidos que requieren mucha energía, incluidos los ganglios de la raíz dorsal, los núcleos del cerebelo dentado, el músculo esquelético y el corazón. Las características clínicas primarias implican una pérdida progresiva de la coordinación y el equilibrio musculares, lo que conduce a la marcha y la ataxia de las extremidades, lo que resulta en una silla de ruedas sujeta a medida que avanza la enfermedad. La cardiomiopatía es la principal causa de muerte en la FA [ 27 , 28 ]. Actualmente no hay terapia aprobada para FA [ 29]. Aquí mostramos que la DMF, aprobada para uso en humanos para la esclerosis múltiple y la psoriasis, induce de manera dependiente de la dosis la expresión de FXN cuya deficiencia es la única causa de la FA, y también induce la biogénesis mitocondrial. Tanto la inducción de FXN como la inducción de biogénesis mitocondrial se producen a ~ 10 μM, que está cerca de la concentración de ~ 7 μM alcanzada por el metabolito bioactivo principal de DMF, MMF, en dosis de 480 mg en humanos.

 

DMF como terapia potencial para FA

Mostramos que el DMF aumenta la expresión de FXN en un 93% en el modelo de células de linfoblastos derivados de FA a una dosis de 30 μM, en un 52% en ratones con FA Yg8 a una dosis de 10 mg / kg y en un 85% en pacientes con EM tratados durante 3 meses. Existe una co-relación positiva entre el nivel de FXN del paciente con FA en la sangre hasta la edad de inicio de la enfermedad [ 30 ]. Este modesto aumento en FXN es altamente relevante desde el punto de vista clínico ya que el aumento en FXN en ~ 80% ( Fig. 2 ) tiene el potencial de retrasar la edad de inicio de FA en muchos años.

También es importante subrayar que la expresión del ARNm de FXN se reduce al 19,4% en pacientes con AF y al 53% en portadores, en comparación con los controles sanos [ 31 ]. Los portadores son individuos sanos que descubren su estado solo durante el asesoramiento genético, y su condición nunca se ha relacionado con ninguna anomalía neurológica o cardiológica. Por lo tanto, el aumento en el ARNm de FXN después del tratamiento con DMF puede ser efectivo para contrarrestar el proceso patológico de reducción de FXN en el aumento encontrado después de la administración in vivo. Por lo tanto, la DMF es única, es segura y bien tolerada, tiene más de 200,000 pacientes tratados en todo el mundo por esclerosis múltiple y psoriasis. Esto sugiere que debe considerarse como una terapia para la ataxia de Friedreich.