Resumen proyecto Ataxia de Friedrich promovido por la plataforma Genefa

Presentamos el informe de seguimiento del proyecto promovido por la plataforma Genefa y Fedaes y llevado a cabo en el IRB de Barcelona y dirigido por la Dra. Meritxell Teixidó. Los resultados finales de este proyecto serán presentados por la investigadora en las Jornadas científicas y de convivencia organizada por la Federación de ataxias de España (Fedaes), que tendrán lugar durante los días 21 al 23 de septiembre en Valladolid.

 

El objetivo principal

del proyecto es desarrollar una terapia génica, basada en nanopartículas (NPs) poliméricas, para tratar la Ataxia de Friedreich. Para alcanzar el objetivo, en los últimos meses nuestro grupo se ha centrado en dos frentes prioritarios:

i) comprobar que el gen completo de la frataxina (BAC-FXN) ha quedado encapsulado en las NPs preparadas y es capaz de transfectar cultivos celulares

ii) obtener el BAC-FXN con una gran pureza y en grandes cantidades.

 

Estudios preliminares,

mostraron que el BAC-FXN se puede encapsular en las NPs de PLGApéptido obteniendo un tamaño inferior a 200 nm (considerado como un tamaño adecuado) y una alta homogeneidad de la muestra. El BAC-FXN, además del gen de la Frataxina, contiene el gen que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP). De este modo, podemos saber más fácilmente si el gen ha podido transfectar las células, ya estas muestran una coloración verde. Estas nanopartículas, que contenían péptidos lanzadera de la barrera hematoencefálica (BHE) y CPPs (Cell penetrating peptides), se probaron con células SH-SY 5Y (células de neuroblastoma y que se utilizan como modelo sencillo de neurona) y se observó una transfección de entre 510% con la mejor de las formulaciones. Aunque el porcentaje de transfección no es muy alto, hay que remarcar que se trata de uno de los primeros estudios que usa NPs encapsulando un plásmido tan grande, como es el gen completo de FXN.

 

 

Para poder preparar y evaluar estas formulaciones

se requiere una cantidad de ADN importante, por lo que se decidió optimizar su preparación y así avanzar más rápidamente con la formulación de NPs. Se están probando varias cepas de E. coli para determinar cual da mejores rendimientos a la hora de amplificar el BAC-FXN. A su vez, conservar la integridad del constructo resulta una tarea complicada, ya que los BAC son muy frágiles y durante su manipulación puede llevar a su ruptura. Por eso, estamos trabajando con varios sistemas de extracción y purificación de plásmidos, para ver cuál de ellos nos da mejor grado de pureza del BAC-FXN.

 

Por otro lado, estamos trabajando en la secuenciación del gen para asegurar su integridad. Para ello, nos hemos puesto en contacto con el CNAG (Centro Nacional de Análisis Genómico). Mediante la técnica “MiSeq” y con la ayuda de la bioinformática, intentaremos secuenciar todo el gen del BAC-FXN y corroborar que el gen preparado sigue siendo el correcto.

 

Las NPs

están formadas por dos bloques diferentes: péptidos conjugados al polímero de PLGA y polímero cargado positivamente para complejar y compactar el ADN. Durante los últimos meses hemos trabajado, en paralelo, en la síntesis de los diferentes bloques necesarios para poder formar las NPs tales como síntesis del péptido lanzadera y del CPP, acople del péptido al polímero de PLGA, etc.

 

También, hemos trabajado en nuevas formulaciones con diferente composición incluyendo un polímero positivo nuevo (jetPEI) para mejorar la transfección del BAC-FXN al interior de las células. También se están realizando pruebas con plásmidos más pequeños para ver la eficacia de este nuevo polímero.

 

Finalmente, una vez comprobado que el BAC-FXN sea capaz de transfectar diferentes modelos celulares, realizaremos el ensayo en modelos celulares de la barrera hematoencefálica (BHE) para ver si estas partículas son capaces de cruzar este modelo celular.